Mephedron (4-Methylmethcathinon) ist ein β-Ketoamphetamin-Stimulans, das dem Methamphetamin strukturell und mechanistisch sehr ähnlich ist. Eine der stärksten Wirkungen von Mephedron ist die Fähigkeit, die Freisetzung von Dopamin (DA) zu stimulieren und seine Wiederaufnahme durch seine Interaktion mit dem Dopamintransporter (DAT) zu blockieren. Obwohl Mephedron keine Toxizität an den DA-Nervenenden verursacht, könnte seine Fähigkeit, als DAT-Blocker zu wirken, wie andere DAT-Inhibitoren einen Schutz vor Methamphetamin-induzierter Neurotoxizität bieten. Um diese Möglichkeit zu testen, wurden Mäuse vor jeder Injektion eines neurotoxischen Methamphetamin-Schemas (4 Injektionen von 2,5 oder 5,0 mg/kg im Abstand von 2 Stunden) mit Mephedron (10, 20 oder 40 mg/kg) behandelt. Die Unversehrtheit der DA-Nervenendigungen im Striatum wurde durch Messung der DA-, DAT- und Tyrosinhydroxylase-Spiegel bewertet. Die mäßige bis schwere DA-Toxizität, die mit den verschiedenen Methamphetamin-Dosen einherging, wurde durch keine Mephedron-Dosis verhindert, sondern sogar noch deutlich verstärkt. Die Hyperthermie, die durch die kombinierte Behandlung mit Mephedron und Methamphetamin verursacht wurde, war die gleiche wie nach der alleinigen Verabreichung einer der beiden Drogen. Mephedron verstärkte auch die neurotoxischen Wirkungen von Amphetamin und MDMA auf die DA-Nervenenden. Im Gegensatz dazu schützte Nomifensin vor der Methamphetamin-induzierten Neurotoxizität. Da Mephedron die Neurotoxizität von Methamphetamin verstärkt, deuten die vorliegenden Ergebnisse darauf hin, dass es mit dem DAT auf eine Weise interagiert, die sich von der anderer typischer DAT-Hemmer unterscheidet. Die relativ harmlosen Auswirkungen von Mephedron allein auf die DA-Nervenenden verdecken eine potenziell gefährliche Interaktion mit Drogen, die häufig zusammen mit Mephedron konsumiert werden, was zu einer verstärkten Neurotoxizität führt.
Mephedron (4-Methylmethcathinon) ist ein Cathinon-Derivat und strukturelles Analogon von Methamphetamin und 3,4-Methylendioxy-Methamphetamin (MDMA). Mephedron ist neben anderen Verbindungen wie Methylon, Butylon und 3,4-Methylendioxypyrovaleron (MDPV) ein psychoaktiver Bestandteil von "Badesalzen". Der Missbrauch von β-Ketoamphetaminen nimmt zu, was nicht zuletzt darauf zurückzuführen ist, dass die Verfügbarkeit der für die Synthese von Methamphetamin und MDMA in illegalen Labors benötigten Ausgangsstoffe stark eingeschränkt ist und ihre Reinheit entsprechend abnimmt (Winstock et al. 2011b, Brunt et al. 2011). Da der Missbrauch von β-Ketoamphetaminen weiter zunimmt, hat sich die Liste ihrer unerwünschten Wirkungen um kardiovaskuläre Komplikationen, Unruhe, Schlaflosigkeit, Psychosen und Depressionen erweitert (Schifano et al. 2011, Prosser und Nelson 2012).
Als chemische Verwandte von Methamphetamin und MDMA ist es nicht überraschend, dass die β-Ketoamphetamine viele der gleichen Wirkungen auf das zentrale Nervensystem haben wie diese Drogen. Beispielsweise blockieren diese Drogen Dopamin- (DA) und Serotonin- (5-HT) Transporter (DAT bzw. SERT) (Cozzi et al. 1999, Rothman et al. 2003, Fleckenstein et al. 2000, Lopez-Arnau et al. 2012) und sie stimulieren die Monoaminfreisetzung in vitro (Kalix und Glennon 1986, Gygi et al. 1997, Rothman et al. 2003) und in vivo (Gygi et al. 1997, Kehr et al. 2011). Methcathinon führt zu einer anhaltenden Verringerung der Tryptophanhydroxylase- und Tyrosinhydroxylase (TH)-Aktivität und zu einer Verarmung von DA und 5-HT (Gygi et al. 1997, Gygi et al. 1996, Sparago et al. 1996). PET-Bildgebungsstudien bei abstinenten Methcathinon-Konsumenten ergaben eine verringerte striatale DAT-Dichte, was auf einen Verlust von DA-Terminals schließen lässt (McCann et al. 1998). Die gleichzeitige Stimulation der DA-Freisetzung und die Hemmung der DA-Aufnahme spiegeln die kritischen Elemente wider, die der mit Methamphetamin assoziierten Neurotoxizität zugrunde liegen (Kuhn et al. 2008, Yamamoto und Bankson 2005, Cadet et al. 2007, Fleckenstein et al. 2007).
Wir (Angoa-Perez et al. 2012) und andere (Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011) haben kürzlich die Möglichkeit untersucht, dass Mephedron wie Methamphetamin und MDMA Neurotoxizität verursachen könnte. Überraschenderweise war Mephedron nicht toxisch für die DA-Nervenenden des Striatums (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Die Frage, ob Mephedron die 5-HT-Nervenenden schädigt, bleibt ungeklärt, da eine Studie positive Wirkungen dokumentierte (Hadlock et al. 2011), während eine andere negativ war (Baumann et al. 2012). Angesichts der relativ günstigen Wirkung von Mephedron auf DA-Nervenenden und seiner Eigenschaften als DAT-Blocker stellten wir die Hypothese auf, dass Mephedron das neuronale DA-System tatsächlich vor den neurotoxischen Wirkungen von Methamphetamin schützen könnte, so wie dies auch bei anderen DAT-Blockern wie Amphonelinsäure (Pu et al. 1994, Schmidt und Gibb 1985, Marek et al. 1990) und Nomifensin (Poth et al. 2012) der Fall ist. Wir berichten, dass Mephedron die Neurotoxizität von Methamphetamin deutlich verstärkt. Diese Wirkung erstreckt sich auch auf Amphetamin und MDMA, Drogen, die häufig zusammen mit Mephedron konsumiert werden (Feyissa und Kelly 2008, Schifano et al. 2011). Diese überraschenden Ergebnisse lassen den Missbrauch von Mephedron in einem neuen Licht erscheinen und erhöhen die Dringlichkeit, diese subtile und gefährliche Eigenschaft dieses β-Ketoamphetamins zu erkennen.
Materialien und Methoden
Drogen und Reagenzien
Mephedronhydrochlorid und 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA) wurden vom NIDA Research Resources Drug Supply Program bezogen. (+) Methamphetaminhydrochlorid, Nomifensinmaleat, d-Amphetaminsulfat, Pentobarbital, DA sowie alle Puffer und HPLC-Reagenzien wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Bicinchoninsäure-Protein-Assay-Kits wurden von Pierce (Rockford, IL, USA) bezogen. Polyklonale Antikörper gegen Ratten-TH wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (Kuhn und Billingsley 1987). Monoklonale Antikörper gegen Ratten-DAT wurden freundlicherweise von Dr. Roxanne A. Vaughan (University of North Dakota, Grand Forks, ND, USA) zur Verfügung gestellt. HRP-konjugierte Anti-IgG-Sekundärantikörper wurden von Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA, USA) zur Verfügung gestellt.
Tiere
Weibliche C57BL/6-Mäuse (Harlan, Indianapolis, IN, USA), die zum Zeitpunkt des Versuchs 20-25 g wogen, wurden zu fünft pro Käfig in großen Schuhkartons in einem hellen (12 h hell/dunkel) und temperaturgeregelten Raum untergebracht. Es wurden weibliche Mäuse verwendet, da sie bekanntermaßen sehr empfindlich auf neuronale Schäden durch die neurotoxischen Amphetamine reagieren, und um die Übereinstimmung mit unseren früheren Studien zur Neurotoxizität von Methamphetamin zu gewährleisten (Thomas et al. 2010, Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009). Die Mäuse hatten freien Zugang zu Futter und Wasser. Das Institutional Care and Use Committee der Wayne State University genehmigte die Tierpflege und die Versuchsverfahren. Alle Verfahren entsprachen auch dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals).
Pharmakologische, physiologische und verhaltensbezogene Verfahren
Die Mäuse wurden mit Mephedron behandelt, und zwar in einem süchtig machenden Schema, das aus vier Injektionen von 10, 20 oder 40 mg/kg mit einem Abstand von 2 Stunden zwischen den einzelnen Injektionen bestand. Dieses Binge-Behandlungsschema führt bei der Injektion von substituierten Amphetaminen und Cathinonderivaten zu einer umfassenden Schädigung der DA-Nervenenden. Die gegenwärtig verwendeten Mephedron-Dosen haben sich zuvor als nicht toxisch für DA-Nervenenden erwiesen (Angoa-Perez et al. 2012). Mäuse wurden mit Methamphetamin (4X 2,5 oder 5 mg/kg), Amphetamin (4X 5 mg/kg) oder MDMA (4X 20 mg/kg) allein oder in Kombination mit Mephedron behandelt. Bei der Behandlung mit zwei Drogen erhielten die Mäuse 30 Minuten vor jeder der vier Injektionen von Methamphetamin, Amphetamin oder MDMA eine Mephedron-Injektion. Die Kontrollpersonen erhielten Injektionen mit physiologischer Kochsalzlösung nach demselben Schema wie Mephedron allein oder in Kombination mit anderen Amphetaminen. Zur Kontrolle der Auswirkungen eines DAT-Hemmers auf die Methamphetamin-Toxizität wurden die Mäuse 30 Minuten vor jeder Injektion von Methamphetamin (4X 5 mg/kg) mit Nomifensin (4X 5 mg/kg) behandelt. Alle Injektionen wurden i.p. verabreicht. Die Mäuse wurden 2 Tage nach der letzten Medikamentenbehandlung getötet, wenn die Amphetamin-assoziierte Neurotoxizität ihr Maximum erreicht hatte. Die Körpertemperatur wurde mit Hilfe von implantierbaren IPTT-300-Temperaturtranspondern von Bio Medic Data Systems, Inc. (Seaford, DE, USA) telemetrisch überwacht. Die Temperaturen wurden nicht-invasiv alle 20 Minuten aufgezeichnet, beginnend 60 Minuten vor der ersten METH-Injektion und für 9 Stunden danach mit dem DAS-5001 Konsolensystem von Bio Medic.
Bestimmung des striatalen DA-Gehalts
Striatales Gewebe wurde nach der Behandlung beidseitig aus dem Gehirn entnommen und bei -80°C gelagert. Das gefrorene Gewebe wurde gewogen und in 10 Volumina 0,16 N Perchlorsäure bei 4°C beschallt. Unlösliches Protein wurde durch Zentrifugation entfernt und DA wurde mittels HPLC mit elektrochemischer Detektion bestimmt, wie zuvor für Methamphetamin beschrieben (Thomas et al. 2010, Thomas et al, 2009).
Bestimmung der TH- und DAT-Proteinspiegel durch Immunoblotting
Die Auswirkungen der Drogenbehandlungen auf die TH- und DAT-Konzentrationen im Striatum wurden durch Immunoblotting als Index für die Toxizität der striatalen DA-Nervenendigungen bestimmt. Die Mäuse wurden nach der Behandlung durch Enthauptung getötet, und das Striatum wurde beidseitig seziert. Das Gewebe wurde bei -80°C gelagert. Das gefrorene Gewebe wurde durch Beschallung in 1%igem SDS bei 95°C aufgeschlossen, und unlösliches Material wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Die Proteine wurden mit der Bicinchoninsäure-Methode bestimmt, und gleiche Proteinmengen (70 μg/Linie) wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und anschließend auf Nitrocellulose geblottet. Die Blots wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in gepufferter Tris-Salzlösung mit Tween 20 (0,1 % v/v) und 5 % fettfreier Trockenmilch blockiert. Primäre Antikörper gegen TH (1:1000) oder DAT (1:1000) wurden auf die Blots aufgetragen und 16 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Die Blots wurden dreimal in Tris-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, um nicht umgesetzte Antikörper zu entfernen, und dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit HRP-konjugiertem Anti-IgG-Sekundärantikörper (1:4000) inkubiert. Die immunreaktiven Banden wurden durch verstärkte Chemilumineszenz sichtbar gemacht, und die relativen Dichten der TH- und DAT-reaktiven Banden wurden durch Bildgebung mit einer Kodak Image Station (Carestream Molecular Systems, Rochester, NY, USA) bestimmt und mit der ImageJ-Software (NIH) quantifiziert.
Auswertung der Daten
Zur Analyse der Dosiseffekte von Methamphetamin und Mephedron auf DA, DAT und TH wurden Zwei-Wege-ANOVAs durchgeführt. Die Auswirkungen der Drogenbehandlungen auf den striatalen DA-, TH- und DAT-Gehalt wurden mittels einseitiger ANOVA und anschließendem Tukey-Vergleichstest auf Signifikanz geprüft. Die Ergebnisse der Arzneimittelbehandlungen auf die Körperkerntemperatur im Laufe der Zeit wurden mit einer Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von einem Bonferroni-Test, analysiert, um die Signifikanz der Temperaturunterschiede zu den einzelnen Zeitpunkten nach der Behandlung zu bestimmen. Unterschiede wurden als signifikant angesehen, wenn p < 0,05. Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism Version 5.02 für Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com) durchgeführt.
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Ergebnisse
Auswirkungen von Mephedron auf die Methamphetamin-induzierte Neurotoxizität
Mephedron in Dosen (10, 20 oder 40 mg/kg), von denen bekannt ist, dass sie keine Toxizität der DA-Nervenenden verursachen (Angoa-Perez et al. 2012), wurde 30 Minuten vor jeder Methamphetamin-Injektion verabreicht. Methamphetamin wurde in Dosen verabreicht, die mäßige (4X 2,5 mg/kg) oder schwere (4X 5 mg/kg) Schäden an den DA-Nervenenden des Striatums verursachen (Thomas et al. 2004, Thomas et al. 2010). Die in Abb. 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Haupteffekte der Methamphetamin-Dosis (F1,40 = 66,60, p < 0,0001) und der Mephedron-Dosis (F4,40 = 131,3, p < 0,0001) auf den DA-Spiegel im Striatum bei der Zwei-Wege-ANOVA hoch signifikant waren. Der Haupteffekt von Mephedron in Kombination mit entweder 2,5 mg/kg (F4,22 = 35,96, p < 0,001) oder 5,0 mg/kg Methamphetamin (F4,17 = 953,9, p < 0,0001) war bei der einseitigen ANOVA ebenfalls hoch signifikant. Alle Behandlungen mit einer der beiden Methamphetamindosen ± Mephedron führten zu einer signifikant stärkeren Verringerung der DA im Vergleich zur jeweiligen Kontrolle (p < 0,0001 für alle). Abb. 1 zeigt auch, dass Mephedron-Dosen von 20 (p < 0,01) und 40 mg/kg (p < 0,001) die abbauenden Wirkungen von 2,5 mg/kg Methamphetamin auf den DA signifikant verstärkten, während alle Mephedron-Dosen die Wirkungen von 5,0 mg/kg Methamphetamin auf den DA-Spiegel signifikant verstärkten (p < 0,0001 für alle).
Abb.1
Auswirkungen von Mephedron auf die Methamphetamin-induzierte Verringerung des striatalen DA-Spiegels. Mäuse wurden 30 Minuten vor jeder Injektion von 2,5 (-) oder 5,0 mg/kg (■) Methamphetamin (METH) mit den angegebenen Mephedron-Dosen (MEPH) behandelt und 2 Stunden später zur Bestimmung der striatalen DA-Konzentration mittels HPLC getötet. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM für 5-7 Mäuse pro Gruppe. Einige Fehlerbalken waren zu klein, um die Größe der Symbole zu überschreiten und sind nicht sichtbar. ***p < 0,001 gegenüber den Kontrollen und #p < 0,01, ##p < 0,001 oder ###p < 0,0001 gegenüber der jeweiligen Methamphetamin-Dosis (Tukey's multipler Vergleichstest).
Abb. 2a zeigt, dass Mephedron die durch Methamphetamin induzierte Verringerung der DAT-Konzentrationen signifikant verstärkte, wie durch Immunoblotting ermittelt wurde. Die Immunoblots wurden quantifiziert, und in Übereinstimmung mit den Ergebnissen für DA waren die Haupteffekte der Methamphetamin-Dosis (F1,92 = 9,48, p < 0,001) und der Mephedron-Dosis (F4,92 = 37,56, p < 0,0001) auf die DAT-Konzentrationen im Striatum durch die Zwei-Wege-ANOVA hoch signifikant (Abb. 2b). Der Haupteffekt von Mephedron in Kombination mit entweder 2,5 mg/kg (F4,56 = 15,55, p < 0,0001) oder 5,0 mg/kg Methamphetamin (F4,39 = 24,84, p < 0,0001) war bei der einseitigen ANOVA ebenfalls hoch signifikant. Alle Behandlungen mit einer der beiden Dosen Methamphetamin ± Mephedron führten zu signifikant stärkeren Reduzierungen der DAT im Vergleich zur jeweiligen Kontrolle (p < 0,01 für 2,5 mg/kg Methamphetamin allein; p < 0,0001 für alle anderen Behandlungen). Abb. 2b zeigt auch, dass Mephedron-Dosen von 20 mg/kg (p < 0,01) und 40 mg/kg (p < 0,001) die durch 2,5 mg/kg Methamphetamin verursachten Reduzierungen der DAT signifikant verstärkten, während nur die 40 mg/kg Mephedron-Dosis die Auswirkungen von 5,0 mg/kg Methamphetamin auf die DAT-Reduktionen signifikant verstärkte (p < 0,01).
Abb.2
Auswirkungen von Mephedron auf Methamphetamin-induzierte Reduzierungen der striatalen DAT. Mäuse wurden 30 Minuten vor jeder Injektion von 2,5 (●) oder 5,0 mg/kg (■) Methamphetamin (METH) mit den angegebenen Mephedron-Dosen (MEPH) behandelt und 2d später für die Bestimmung der striatalen DAT-Konzentrationen durch Immunoblotting (a) getötet. Die Blots wurden mit ImageJ quantifiziert und die Daten sind Mittelwerte ± SEM für 10-12 Mäuse pro Gruppe (b). *p < 0,01 oder ***p < 0,0001 gegenüber der Kontrolle (C) und #p < 0,01 oder ##p < 0,001 gegenüber der jeweiligen Methamphetamin-Dosis (Tukey's multipler Vergleichstest).
Abb. 3a zeigt, dass Mephedron die durch Methamphetamin induzierte Verringerung des TH-Spiegels signifikant verstärkt, wie durch Immunoblotting ermittelt wurde. Die Immunoblots wurden quantifiziert, und in Übereinstimmung mit den obigen Ergebnissen für DA und DAT waren die Haupteffekte der Methamphetamin-Dosis (F1,81 = 47,89, p < 0,0001) und der Mephedron-Dosis (F4,81 = 63,57, p < 0,0001) durch eine Zweiwege-ANOVA hoch signifikant (Abb. 3b). Der Haupteffekt von Mephedron in Kombination mit entweder 2,5 mg/kg (F4,34 = 12,98, p < 0,0001) oder 5,0 mg/kg Methamphetamin (F4,49 = 99,16, p < 0,0001) war bei der einseitigen ANOVA ebenfalls hoch signifikant. Alle Behandlungen mit einer der beiden Dosen Methamphetamin ± Mephedron führten zu einer signifikant stärkeren Verringerung der TH-Werte im Vergleich zur jeweiligen Kontrolle (p < 0,001 für 2,5 mg/kg Methamphetamin + 10 mg/kg Mephedron; p < 0,0001 für alle anderen Kombinationen), mit Ausnahme von 2,5 mg/kg Methamphetamin allein, das die TH-Werte nicht signifikant veränderte (d. h. keine Toxizität). Abb. 3b zeigt auch, dass Mephedron-Dosen von 20 mg/kg (p < 0,01) und 40 mg/kg (p < 0,001) die durch 2,5 mg/kg Methamphetamin verursachten TH-Reduktionen signifikant verstärkten, und alle drei Mephedron-Dosen verstärkten signifikant (p < 0,0001) die Auswirkungen von 5,0 mg/kg Methamphetamin auf die TH-Reduktionen.
Abb. 3.
Auswirkungen von Mephedron auf die Methamphetamin-induzierte Verringerung des striatalen TH. Mäuse wurden 30 Minuten vor jeder Injektion von 2,5 (●) oder 5,0 mg/kg (■) Methamphetamin (METH) mit den angegebenen Mephedron-Dosen (MEPH) behandelt und 2d später für die Bestimmung der striatalen TH-Konzentrationen durch Immunoblotting (a) getötet. Die Blots wurden mit ImageJ quantifiziert und die Daten sind Mittelwerte ± SEM für 10-12 Mäuse pro Gruppe (b). Einige Fehlerbalken waren zu klein, um die Größe der Symbole zu überschreiten, und sind daher nicht sichtbar. **p < 0,001 oder ***p < 0,0001 gegenüber der Kontrolle (C) und #p < 0,01, ##p < 0,001 oder ###p < 0,0001) gegenüber der jeweiligen Methamphetamin-Dosis (Tukey's multipler Vergleichstest).
Auswirkungen von Mephedron auf die Methamphetamin-induzierte Hyperthermie
Mephedron verursacht ebenso wie Methamphetamin eine erhebliche Hyperthermie (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Wenn Mephedron 30 Minuten vor jeder Methamphetamin-Injektion verabreicht wurde, ist in Abb. 4 zu erkennen, dass die Haupteffekte der Methamphetamin- und Mephedron-Dosen (F1,300 = 11,99, p < 0,0001) über die Zeit (F4,300 = 51,73, p < 0,0001) durch die Zwei-Wege-ANOVA hoch signifikant waren. Die Haupteffekte von Mephedron, das in Kombination mit entweder 2,5 mg/kg Methamphetamin (F4,120 = 41,44, p < 0,0001, Feld a) über die Zeit (F30,120 = 3,84, p < 0,0001) oder 5,0 mg/kg Methamphetamin (F4,120 = 78,09, p < 0,0001, Feld b) über die Zeit (F30,120 = 9,98, p < 0,0001) verabreicht wurde, waren bei der zweifachen ANOVA ebenfalls hoch signifikant. Alle Behandlungen mit einer der beiden Dosen von Methamphetamin ± Mephedron unterschieden sich signifikant von den jeweiligen Kontrollen (p < 0,0001 für alle Behandlungen).
Abb. 4
Auswirkungen von Mephedron auf die Methamphetamin-induzierte Hyperthermie. Mäuse wurden 30 Minuten vor jeder Injektion von 2,5 (a) oder 5,0 mg/kg (b) Methamphetamin (METH) mit den angegebenen Mephedron-Dosen (MEPH) behandelt. Die Kerntemperaturen wurden ab 60 Minuten vor der ersten Methamphetamin-Injektion in 20-minütigen Abständen mittels Telemetrie gemessen. Die 4 Methamphetamin-Injektionen sind durch die auf der x-Achse ruhenden Pfeile gekennzeichnet. Die Daten sind als mittlere Körpertemperatur von 6-8 Mäusen pro Gruppe angegeben. Die SEMs betrugen immer < 10 % des Mittelwerts und werden aus Gründen der Übersichtlichkeit weggelassen.
Auswirkungen von Mephedron auf die Amphetamin- und MDMA-induzierte Neurotoxizität
Um zu prüfen, ob die verstärkenden Wirkungen von Mephedron auf Methamphetamin auf andere neurotoxische Amphetamine ausgedehnt werden können, wurden Mäuse mit diesem β-Ketoamphetamin (20 mg/kg) plus Amphetamin (4X 5 mg/kg) oder MDMA (4X 20 mg/kg) behandelt, und die Ergebnisse sind in Abb. 5 dargestellt. Es sei daran erinnert, dass Mephedron selbst keine Reduktion von striatalem DA, DAT oder TH bewirkt (Angoa-Perez et al. 2012). Der Haupteffekt der Droge (F5,27 = 27,18, p < 0,0001) war bei der einseitigen ANOVA für die DA-Reduktionen hoch signifikant (Abb. 5a). Aus Abb. 5a ist auch ersichtlich, dass alle Behandlungen mit Amphetamin (p < 0,001) oder MDMA (p < 0,001) allein oder in Kombination mit Mephedron (p < 0,0001 für beide Drogen) die DA-Werte gegenüber der Kontrolle signifikant senkten. Mephedron verstärkte signifikant die durch Amphetamin (p < 0,01) oder MDMA (p < 0,01) verursachten DA-Reduktionen. Abb. 5b zeigt ähnliche Auswirkungen der kombinierten Drogenbehandlung auf die DAT-Spiegel im Striatum. Der Haupteffekt der Droge (F4,49 = 42,63, p < 0,0001) war bei einer einseitigen ANOVA für DAT hoch signifikant. In Abb. 5b ist auch zu erkennen, dass alle Behandlungen mit Amphetamin oder MDMA im Vergleich zur Kontrolle signifikant (p < 0,0001 für alle) niedriger waren. Mephedron verstärkte auch signifikant die durch Amphetamin oder MDMA verursachten DAT-Reduktionen (p < 0,0001 in beiden Fällen). Schließlich zeigt Abb. 5c, dass der Haupteffekt der Droge (F4,50 = 75,06, p < 0,0001) bei der einseitigen ANOVA für die Verringerung der TH hoch signifikant war. In Abb. 5c ist auch zu erkennen, dass alle Behandlungen mit Amphetamin oder MDMA im Vergleich zur Kontrolle signifikant (p < 0,0001 für alle) niedriger waren. Mephedron verstärkte auch signifikant die durch Amphetamin oder MDMA verursachten TH-Reduktionen (p < 0,0001 in beiden Fällen)
Abb. 5.
Auswirkungen von Mephedron auf die Amphetamin- oder MDMA-induzierte Neurotoxizität der DA-Nervenenden. Mäuse wurden 30 Minuten vor jeder Injektion von 5,0 mg/kg Amphetamin (AMPH) oder 20 mg/kg MDMA mit 20 mg/kg Mephedron (MEPH) behandelt und 2d nach der Behandlung zur Bestimmung der striatalen (a) DA-Konzentrationen mittels HPLC geopfert. (b) DAT und (c) TH wurden durch Immunoblotting bestimmt, und die Blots wurden mit ImageJ quantifiziert. Repräsentative Immunoblots für DAT und TH sind als Einschübe in den Tafeln (b) bzw. (c) zu sehen, und die Behandlungen sind in beiden Tafeln mit 1,5: Kontrolle; 2,6: MEPH; 3: AMPH; 4: AMPH + MEPH; 7: MDMA; und 8: MDMA + MEPH angegeben. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM für 5-12 Mäuse in jeder Gruppe. **p < 0,001 oder ***p < 0,0001 gegenüber der Kontrolle und #p < 0,01 oder ###p < 0,0001 gegenüber AMPH oder MDMA (Tukey's multipler Vergleichstest).
Auswirkungen von Nomifensin auf die Methamphetamin-induzierte Neurotoxizität
Nomifensin, ein starker DAT-Blocker ohne bekanntes Missbrauchs- oder neurotoxisches Potenzial, wurde auf seine Fähigkeit getestet, vor Methamphetamin-induzierter Neurotoxizität zu schützen, und auf den Kontrast zu den Wirkungen von Mephedron auf die durch Methamphetamin, Amphetamin und MDMA verursachte Toxizität an DA-Nervenenden. Die Ergebnisse in Abb. 6a zeigen, dass der Haupteffekt der Droge (F3,16 = 63,39, p < 0,0001) auf den DA-Spiegel bei einer einseitigen ANOVA hoch signifikant war. Nomifensin allein veränderte den DA-Spiegel nicht, aber die durch Methamphetamin verursachte Verringerung (p < 0,0001) wurde durch Nomifensin leicht, aber signifikant aufgehoben (p < 0,01). Der Haupteffekt der Droge (F3,20 = 16,78, p < 0,0001) auf die DAT-Konzentrationen war bei einer einseitigen ANOVA hoch signifikant, wie in Abb. 6b gezeigt. Nomifensin veränderte die DAT-Spiegel nicht, bot jedoch im Vergleich zur Kontrolle einen signifikanten Schutz (p < 0,001) vor der durch Methamphetamin verursachten Verringerung der striatalen DAT (p < 0,0001). Schließlich zeigt Abb. 6c, dass der Haupteffekt der Droge (F3,15 = 14,10, p < 0,0001) auf die TH-Konzentrationen bei einer einseitigen ANOVA hoch signifikant war. Wie bei DA und DAT wurde die durch Methamphetamin verursachte Verringerung der TH-Werte (p < 0,0001) durch Nomifensin (p < 0,01) leicht, aber signifikant verhindert.
Abb. 6.
Auswirkungen von Nomifensin auf die Methamphetamin-induzierte Neurotoxizität der DA-Nervenenden. Mäuse wurden 30 Minuten vor jeder Injektion von 5,0 mg/kg Methamphetamin (METH) mit 5,0 mg/kg Nomifensin (NOM) behandelt und 2 Stunden später zur Bestimmung der striatalen (a) DA-Konzentration mittels HPLC getötet. (b) DAT und (c) TH wurden durch Immunoblotting bestimmt und die Blots wurden mit ImageJ quantifiziert. Repräsentative Immunoblots für DAT und TH sind in den Feldern (b) bzw. (c) als Beilage dargestellt. Die Daten sind Mittelwerte plus SEM für 5-7 Mäuse pro Gruppe. ***p < 0,0001 gegenüber der Kontrolle (C) und #p < 0,01 oder ##p < 0,001 gegenüber Methamphetamin allein (Tukey's multipler Vergleichstest).
Diskussion
Ziel der vorliegenden Studie war es, festzustellen, ob Mephedron die durch Methamphetamin verursachte Toxizität der DA-Nervenenden verhindern kann. Aufgrund seiner chemischen Ähnlichkeit mit Methamphetamin und MDMA wurde zunächst erwartet, dass Mephedron schädliche Auswirkungen auf das neuronale DA-System haben würde. In mehreren Studien wurde jedoch fast gleichzeitig festgestellt, dass Mephedron für DA-Nervenendigungen nicht toxisch ist (Angoa-Perez et al. 2012, Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011). Die Frage, ob diese Droge Schäden am neuronalen 5-HT-System verursacht, bleibt offen. In einer Studie wurde über eine anhaltende Verringerung der Funktion von 5-HT-Nervenenden berichtet (Hadlock et al. 2011), während in einer anderen Studie festgestellt wurde, dass Mephedron keine Schäden verursacht (Baumann et al. 2012). Mephedron interagiert mit der DA-Nervenendigung in einer Weise, die darauf schließen lässt, dass es tatsächlich die Freisetzung stimuliert und die DA-Wiederaufnahme über seine Interaktionen mit dem DAT blockiert. Ein wichtiger Aspekt des neurotoxischen Wirkmechanismus von Methamphetamin ist seine Fähigkeit, über die DAT Zugang zu den DA-Nervenenden zu erhalten und die DA-Homöostase zu stören (Sulzer 2011). Wenn dieser frühe Schritt in der neurotoxischen Kaskade von Methamphetamin durch Hemmung der DAT verhindert wird, wird die Toxizität verhindert (Pu et al. 1994, Poth et al. 2012, Marek et al. 1990, Schmidt und Gibb 1985). Wir gingen davon aus, dass Mephedron dieselbe schützende Wirkung haben könnte wie andere DAT-Hemmer, beobachteten aber stattdessen eine deutliche Verstärkung der Toxizität. Diese Wechselwirkung wurde mit zwei verschiedenen Methamphetamin-Dosen beobachtet, die mäßige bzw. schwere Schäden an den DA-Nervenenden verursachen (4X 2,5 bzw. 5,0 mg/kg). Diese potenzierende Wirkung von Mephedron war nicht auf Methamphetamin beschränkt, sondern erstreckte sich auch auf Amphetamin und MDMA, zwei Drogen, die häufig gemeinsam mit Mephedron und anderen β-Ketoamphetaminen konsumiert werden (Feyissa und Kelly 2008, Schifano et al. 2011, Kelly 2011). Obwohl Mephedron also zumindest für die DA-Nervenendigungen des Striatums keine Toxizität verursacht, verstärkt es die neurotoxischen Wirkungen anderer Drogen des Missbrauchs. Diese neue Erkenntnis sollte den Mephedron-Missbrauch in ein noch schärferes Licht rücken, da das Fehlen einer intrinsischen Neurotoxizität es als harmlos erscheinen lassen könnte.
Hyperthermie ist eine häufig berichtete akute unerwünschte Wirkung der Einnahme von Methamphetamin (Greene et al. 2008) und β-Ketoamphetamin beim Menschen (Borek und Holstege 2012, Prosser und Nelson 2012). Wie Methamphetamin führen auch viele der β-Ketoamphetamin-Drogen zu einer signifikanten Erhöhung der Kerntemperatur bei Nagern (Angoa-Perez et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Rockhold et al. 1997). Die durch Methamphetamin verursachte Hyperthermie könnte zwar zu den morphologischen und neuronalen Schäden beitragen, muss aber nicht unbedingt die direkte Ursache dieser Wirkungen sein (Kiyatkin und Sharma 2009). Wir haben die Körperkerntemperaturen von Mäusen gemessen, die mit Mephedron und Methamphetamin behandelt wurden, und festgestellt, dass die kombinierte Behandlung die Temperaturen nicht über den maximalen Anstieg hinaus erhöhte, der nach der alleinigen Behandlung mit einer der beiden Drogen beobachtet wurde. Methamphetamin verursachte einen dosisabhängigen Anstieg der Körpertemperatur, und diese Hyperthermie blieb über den gesamten getesteten Mephedron-Dosisbereich unverändert. Der nach der Mephedron-Behandlung beobachtete Rückgang der Körpertemperatur nach der Injektion (Angoa-Perez et al. 2012) blieb auch bei höheren Mephedron- und Methamphetamin-Dosen bestehen. Auch wenn die drogeninduzierte Hyperthermie durch die kombinierte Drogenbehandlung nicht verstärkt wurde, waren die neurotoxischen Wirkungen additiv. Daher scheint es zumindest im vorliegenden Fall, dass die neurotoxischen Wirkungen von Methamphetamin durch Mephedron auf eine Weise verstärkt werden können, die unabhängig von der Hyperthermie ist.
Mephedron hemmt eindeutig die DAT-Funktion und blockiert die DA-Wiederaufnahme in vitro (Lopez-Arnau et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Kehr et al. 2011, Martinez-Clemente et al. 2012, Cozzi et al. 1999). Mephedron verdrängt WIN-35,428 von seiner Bindungsstelle am DAT, was darauf hindeutet, dass es ein kompetitiver Inhibitor der DA-Aufnahme ist (Martinez-Clemente et al. 2012, Lopez-Arnau et al. 2012). Die Potenz von Mephedron ist in dieser Hinsicht sehr ähnlich wie die von Methamphetamin (Cozzi et al. 1999) und MDMA (Escubedo et al. 2011). Es ist nicht bekannt, ob Mephedron über den DAT transportiert wird, Methcathinon hingegen schon (Cozzi und Foley 2003). Nomifensin und Amphonelinsäure, die an die DAT binden und die DA-Aufnahme hemmen, bieten einen erheblichen Schutz vor Methamphetamin-induzierter Neurotoxizität (Pu et al. 1994, Marek et al. 1990, Schmidt und Gibb 1985, Poth et al. 2012), und Mäuse, denen die DAT fehlt, sind resistent gegen die neuronale Toxizität von Methamphetamin (Fumagalli et al. 1998). Das Wissen, dass Mephedron nicht neurotoxisch und ein DAT-Blocker ist, führt zu der Vorhersage, dass es die Toxizität verhindern sollte. Wir testeten Nomifensin in dieser Hinsicht als Positivkontrolle und bestätigten, dass es vor der Methamphetamin-induzierten Depletion von DA, DAT und TH schützt. Nomifensin hemmt auch den Noradrenalin-Transporter (Brogden et al. 1979), aber diese Eigenschaft kann die vorliegenden Ergebnisse nicht erklären, da die meisten β-Ketoamphetamine, einschließlich Mephedron, den Noradrenalin-Transporter hemmen und die Noradrenalin-Aufnahme blockieren (Kelly 2011, Rothman et al. 2003, Cozzi et al. 1999, Sogawa et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012). Eine Rolle des neuronalen 5-HT-Systems bei einigen der pharmakologischen Wirkungen von Mephedron ist möglich, da diese Droge wie MDMA (Yamamoto et al. 1995) in der Lage ist, über ihre Wechselwirkungen mit 5-HT2A-Rezeptoren einen Efflux von striatalem DA zu verursachen (Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012). Die durch Mephedron hervorgerufene Hyperbewegung ist von endogenem 5-HT abhängig (Lopez-Arnau et al. 2012), und diese Droge stimuliert auch die Freisetzung von 5-HT und hemmt dessen Aufnahme in vitro (Sogawa et al. 2011, Cozzi et al. 1999, Nagai et al. 2007, Hadlock et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012) und in vivo (Baumann et al. 2012, Kehr et al. 2011). Wir können jedoch ausschließen, dass endogenes 5-HT bei der DA-Neurotoxizität zumindest von Methamphetamin eine Rolle spielt, da wir zeigen konnten, dass Mäuse, denen genetisch 5-HT entzogen wurde, ihre Empfindlichkeit gegenüber Neurotoxizität beibehalten (Thomas et al. 2010).
Mephedron könnte die Neurotoxizität von Methamphetamin durch mehrere mögliche Mechanismen verstärken. Erstens könnte Mephedron mit der VMAT interagieren und ein Austreten von DA in das Zytoplasma der präsynaptischen Nervenendigung bewirken. Behandlungen, die den zytoplasmatischen DA-Pool (d. h. den durch die Droge freisetzbaren) erhöhen, steigern die Neurotoxizität von Methamphetamin (Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009, Schmidt et al. 1985). Dieser Mechanismus ist nicht wahrscheinlich, da Methcathinon nur schwach mit dem VMAT interagiert (Cozzi et al. 1999). Zweitens könnte die Kombination von Mephedron und Methamphetamin eine synergistische Wirkung auf die nichtvesikuläre Freisetzung von DA haben, aber auch diese Möglichkeit erscheint unwahrscheinlich angesichts der Ergebnisse, die zeigen, dass die Behandlung von DAT- oder SERT-exprimierenden CHO-Zellen mit Methylon plus Methamphetamin keine additive Wirkung auf die DA- oder 5-HT-Freisetzung hat (Sogawa et al. 2011). Drittens könnte Mephedron auf eine neuartige Weise mit der DAT interagieren, die zur additiven Toxizität beiträgt. Es wurde nachgewiesen, dass Methylon in Kombination mit Methamphetamin in CHO-Zellen, die den DAT oder SERT exprimieren, eine synergistische Zytotoxizität verursacht, nicht aber in CHO-Wildtyp-Zellen, denen diese Transporter fehlen (Sogawa et al. 2011). Die in diesen Studien in kultivierten Zellen beobachtete Zytotoxizität (d. h. die LDH-Freisetzung) unterscheidet sich stark von der durch Methamphetamin verursachten Schädigung der DA-Nervenendigungen, aber dieser Mechanismus deutet auf eine interessante, aber nicht definierte Rolle des DAT bei der erhöhten Zytotoxizität hin. Schließlich könnte Mephedron den Methamphetamin-Metabolismus verändern. Mephedron wird hauptsächlich durch N-Demethylierung metabolisiert (Meyer und Maurer 2010), ebenso wie Methamphetamin und MDMA (Caldwell 1976). Unterstützt wird dieser Mechanismus durch den Nachweis, dass Methamphetamin und MDMA gegenseitig die Produktion ihrer jeweiligen primären Metaboliten hemmen und die Plasmaspiegel der Droge über die nach der Verabreichung einer der beiden Drogen allein gemessenen Werte hinaus erhöhen (Kuwayama et al. 2012). Die hier und in unserer früheren Studie (Angoa-Perez et al. 2012) verwendeten Mephedron-Dosen sind zwar hoch, aber nicht neurotoxisch und liegen im Bereich des menschlichen Missbrauchs (McErath und O'Neill 2011). Daher könnte Mephedron ähnlich wie MDMA die Plasmaspiegel von Methamphetamin erhöhen, indem es dessen Metabolismus hemmt. Eine eingehende pharmakokinetische Analyse wird erforderlich sein, um diese letzte Möglichkeit zu bestätigen.
Der Missbrauch von β-Ketoamphetaminen nimmt in besorgniserregendem Maße zu, und Mephedron ist inzwischen eine der am häufigsten konsumierten Drogen nach Cannabis, MDMA und Kokain (Morris 2010, Winstock et al. 2011b). Darüber hinaus löst Mephedron bei Menschen im Vergleich zu MDMA ein stärkeres Verlangen aus (Brunt et al. 2011), und Konsumenten, die Mephedron schnupfen, schätzen es als süchtig machender ein als Kokain (Winstock et al. 2011b). Mephedron wird von Menschen in Form von Saufgelagen (d. h. "Stacking") konsumiert und häufig zusammen mit anderen Drogen wie Cannabis und Amphetamin-Psychostimulanzien eingenommen (Schifano et al. 2011, Fass et al. 2012, Winstock et al. 2011a, Kelly 2011, Torrance und Cooper 2010). Mephedron wird zunehmend in Tabletten gefunden, die als MDMA verkauft werden (Brunt et al. 2011), und sein Konsum wird wahrscheinlich den von MDMA übertreffen, da der Reinheitsgrad der letzteren Droge weiter sinkt (Brunt et al. 2011, Tanner-Smith 2006, Teng et al. 2006). Angesichts der verbreiteten Missbrauchsmuster von Mephedron und anderen "Badesalz"-Bestandteilen ist es wichtig zu prüfen, ob beim Menschen zusätzliche Gesundheitsrisiken entstehen, wenn diese Drogen absichtlich oder unabsichtlich mit Amphetaminen kombiniert werden. Unsere Ergebnisse, die zeigen, dass zumindest Mephedron die durch Methamphetamin, Amphetamin und MDMA verursachte Neurotoxizität an den DA-Nervenenden des Striatums deutlich verstärkt, offenbaren eine besonders gefährliche und unerwartete Eigenschaft dieses β-Ketoamphetamins.
Verwendete Abkürzungen
5-HT Serotonin
DA Dopamin
DAT DA-Transporter
MDMA 3,4-Methylendioxymethamphetamin
TH Tyrosin-Hydroxylase
VMAT vesikulärer Monoamintransporter
Mephedron (4-Methylmethcathinon) ist ein Cathinon-Derivat und strukturelles Analogon von Methamphetamin und 3,4-Methylendioxy-Methamphetamin (MDMA). Mephedron ist neben anderen Verbindungen wie Methylon, Butylon und 3,4-Methylendioxypyrovaleron (MDPV) ein psychoaktiver Bestandteil von "Badesalzen". Der Missbrauch von β-Ketoamphetaminen nimmt zu, was nicht zuletzt darauf zurückzuführen ist, dass die Verfügbarkeit der für die Synthese von Methamphetamin und MDMA in illegalen Labors benötigten Ausgangsstoffe stark eingeschränkt ist und ihre Reinheit entsprechend abnimmt (Winstock et al. 2011b, Brunt et al. 2011). Da der Missbrauch von β-Ketoamphetaminen weiter zunimmt, hat sich die Liste ihrer unerwünschten Wirkungen um kardiovaskuläre Komplikationen, Unruhe, Schlaflosigkeit, Psychosen und Depressionen erweitert (Schifano et al. 2011, Prosser und Nelson 2012).
Als chemische Verwandte von Methamphetamin und MDMA ist es nicht überraschend, dass die β-Ketoamphetamine viele der gleichen Wirkungen auf das zentrale Nervensystem haben wie diese Drogen. Beispielsweise blockieren diese Drogen Dopamin- (DA) und Serotonin- (5-HT) Transporter (DAT bzw. SERT) (Cozzi et al. 1999, Rothman et al. 2003, Fleckenstein et al. 2000, Lopez-Arnau et al. 2012) und sie stimulieren die Monoaminfreisetzung in vitro (Kalix und Glennon 1986, Gygi et al. 1997, Rothman et al. 2003) und in vivo (Gygi et al. 1997, Kehr et al. 2011). Methcathinon führt zu einer anhaltenden Verringerung der Tryptophanhydroxylase- und Tyrosinhydroxylase (TH)-Aktivität und zu einer Verarmung von DA und 5-HT (Gygi et al. 1997, Gygi et al. 1996, Sparago et al. 1996). PET-Bildgebungsstudien bei abstinenten Methcathinon-Konsumenten ergaben eine verringerte striatale DAT-Dichte, was auf einen Verlust von DA-Terminals schließen lässt (McCann et al. 1998). Die gleichzeitige Stimulation der DA-Freisetzung und die Hemmung der DA-Aufnahme spiegeln die kritischen Elemente wider, die der mit Methamphetamin assoziierten Neurotoxizität zugrunde liegen (Kuhn et al. 2008, Yamamoto und Bankson 2005, Cadet et al. 2007, Fleckenstein et al. 2007).
Wir (Angoa-Perez et al. 2012) und andere (Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011) haben kürzlich die Möglichkeit untersucht, dass Mephedron wie Methamphetamin und MDMA Neurotoxizität verursachen könnte. Überraschenderweise war Mephedron nicht toxisch für die DA-Nervenenden des Striatums (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Die Frage, ob Mephedron die 5-HT-Nervenenden schädigt, bleibt ungeklärt, da eine Studie positive Wirkungen dokumentierte (Hadlock et al. 2011), während eine andere negativ war (Baumann et al. 2012). Angesichts der relativ günstigen Wirkung von Mephedron auf DA-Nervenenden und seiner Eigenschaften als DAT-Blocker stellten wir die Hypothese auf, dass Mephedron das neuronale DA-System tatsächlich vor den neurotoxischen Wirkungen von Methamphetamin schützen könnte, so wie dies auch bei anderen DAT-Blockern wie Amphonelinsäure (Pu et al. 1994, Schmidt und Gibb 1985, Marek et al. 1990) und Nomifensin (Poth et al. 2012) der Fall ist. Wir berichten, dass Mephedron die Neurotoxizität von Methamphetamin deutlich verstärkt. Diese Wirkung erstreckt sich auch auf Amphetamin und MDMA, Drogen, die häufig zusammen mit Mephedron konsumiert werden (Feyissa und Kelly 2008, Schifano et al. 2011). Diese überraschenden Ergebnisse lassen den Missbrauch von Mephedron in einem neuen Licht erscheinen und erhöhen die Dringlichkeit, diese subtile und gefährliche Eigenschaft dieses β-Ketoamphetamins zu erkennen.
Materialien und Methoden
Drogen und Reagenzien
Mephedronhydrochlorid und 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA) wurden vom NIDA Research Resources Drug Supply Program bezogen. (+) Methamphetaminhydrochlorid, Nomifensinmaleat, d-Amphetaminsulfat, Pentobarbital, DA sowie alle Puffer und HPLC-Reagenzien wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Bicinchoninsäure-Protein-Assay-Kits wurden von Pierce (Rockford, IL, USA) bezogen. Polyklonale Antikörper gegen Ratten-TH wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (Kuhn und Billingsley 1987). Monoklonale Antikörper gegen Ratten-DAT wurden freundlicherweise von Dr. Roxanne A. Vaughan (University of North Dakota, Grand Forks, ND, USA) zur Verfügung gestellt. HRP-konjugierte Anti-IgG-Sekundärantikörper wurden von Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA, USA) zur Verfügung gestellt.
Tiere
Weibliche C57BL/6-Mäuse (Harlan, Indianapolis, IN, USA), die zum Zeitpunkt des Versuchs 20-25 g wogen, wurden zu fünft pro Käfig in großen Schuhkartons in einem hellen (12 h hell/dunkel) und temperaturgeregelten Raum untergebracht. Es wurden weibliche Mäuse verwendet, da sie bekanntermaßen sehr empfindlich auf neuronale Schäden durch die neurotoxischen Amphetamine reagieren, und um die Übereinstimmung mit unseren früheren Studien zur Neurotoxizität von Methamphetamin zu gewährleisten (Thomas et al. 2010, Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009). Die Mäuse hatten freien Zugang zu Futter und Wasser. Das Institutional Care and Use Committee der Wayne State University genehmigte die Tierpflege und die Versuchsverfahren. Alle Verfahren entsprachen auch dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals).
Pharmakologische, physiologische und verhaltensbezogene Verfahren
Die Mäuse wurden mit Mephedron behandelt, und zwar in einem süchtig machenden Schema, das aus vier Injektionen von 10, 20 oder 40 mg/kg mit einem Abstand von 2 Stunden zwischen den einzelnen Injektionen bestand. Dieses Binge-Behandlungsschema führt bei der Injektion von substituierten Amphetaminen und Cathinonderivaten zu einer umfassenden Schädigung der DA-Nervenenden. Die gegenwärtig verwendeten Mephedron-Dosen haben sich zuvor als nicht toxisch für DA-Nervenenden erwiesen (Angoa-Perez et al. 2012). Mäuse wurden mit Methamphetamin (4X 2,5 oder 5 mg/kg), Amphetamin (4X 5 mg/kg) oder MDMA (4X 20 mg/kg) allein oder in Kombination mit Mephedron behandelt. Bei der Behandlung mit zwei Drogen erhielten die Mäuse 30 Minuten vor jeder der vier Injektionen von Methamphetamin, Amphetamin oder MDMA eine Mephedron-Injektion. Die Kontrollpersonen erhielten Injektionen mit physiologischer Kochsalzlösung nach demselben Schema wie Mephedron allein oder in Kombination mit anderen Amphetaminen. Zur Kontrolle der Auswirkungen eines DAT-Hemmers auf die Methamphetamin-Toxizität wurden die Mäuse 30 Minuten vor jeder Injektion von Methamphetamin (4X 5 mg/kg) mit Nomifensin (4X 5 mg/kg) behandelt. Alle Injektionen wurden i.p. verabreicht. Die Mäuse wurden 2 Tage nach der letzten Medikamentenbehandlung getötet, wenn die Amphetamin-assoziierte Neurotoxizität ihr Maximum erreicht hatte. Die Körpertemperatur wurde mit Hilfe von implantierbaren IPTT-300-Temperaturtranspondern von Bio Medic Data Systems, Inc. (Seaford, DE, USA) telemetrisch überwacht. Die Temperaturen wurden nicht-invasiv alle 20 Minuten aufgezeichnet, beginnend 60 Minuten vor der ersten METH-Injektion und für 9 Stunden danach mit dem DAS-5001 Konsolensystem von Bio Medic.
Bestimmung des striatalen DA-Gehalts
Striatales Gewebe wurde nach der Behandlung beidseitig aus dem Gehirn entnommen und bei -80°C gelagert. Das gefrorene Gewebe wurde gewogen und in 10 Volumina 0,16 N Perchlorsäure bei 4°C beschallt. Unlösliches Protein wurde durch Zentrifugation entfernt und DA wurde mittels HPLC mit elektrochemischer Detektion bestimmt, wie zuvor für Methamphetamin beschrieben (Thomas et al. 2010, Thomas et al, 2009).
Bestimmung der TH- und DAT-Proteinspiegel durch Immunoblotting
Die Auswirkungen der Drogenbehandlungen auf die TH- und DAT-Konzentrationen im Striatum wurden durch Immunoblotting als Index für die Toxizität der striatalen DA-Nervenendigungen bestimmt. Die Mäuse wurden nach der Behandlung durch Enthauptung getötet, und das Striatum wurde beidseitig seziert. Das Gewebe wurde bei -80°C gelagert. Das gefrorene Gewebe wurde durch Beschallung in 1%igem SDS bei 95°C aufgeschlossen, und unlösliches Material wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Die Proteine wurden mit der Bicinchoninsäure-Methode bestimmt, und gleiche Proteinmengen (70 μg/Linie) wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und anschließend auf Nitrocellulose geblottet. Die Blots wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in gepufferter Tris-Salzlösung mit Tween 20 (0,1 % v/v) und 5 % fettfreier Trockenmilch blockiert. Primäre Antikörper gegen TH (1:1000) oder DAT (1:1000) wurden auf die Blots aufgetragen und 16 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Die Blots wurden dreimal in Tris-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, um nicht umgesetzte Antikörper zu entfernen, und dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit HRP-konjugiertem Anti-IgG-Sekundärantikörper (1:4000) inkubiert. Die immunreaktiven Banden wurden durch verstärkte Chemilumineszenz sichtbar gemacht, und die relativen Dichten der TH- und DAT-reaktiven Banden wurden durch Bildgebung mit einer Kodak Image Station (Carestream Molecular Systems, Rochester, NY, USA) bestimmt und mit der ImageJ-Software (NIH) quantifiziert.
Auswertung der Daten
Zur Analyse der Dosiseffekte von Methamphetamin und Mephedron auf DA, DAT und TH wurden Zwei-Wege-ANOVAs durchgeführt. Die Auswirkungen der Drogenbehandlungen auf den striatalen DA-, TH- und DAT-Gehalt wurden mittels einseitiger ANOVA und anschließendem Tukey-Vergleichstest auf Signifikanz geprüft. Die Ergebnisse der Arzneimittelbehandlungen auf die Körperkerntemperatur im Laufe der Zeit wurden mit einer Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von einem Bonferroni-Test, analysiert, um die Signifikanz der Temperaturunterschiede zu den einzelnen Zeitpunkten nach der Behandlung zu bestimmen. Unterschiede wurden als signifikant angesehen, wenn p < 0,05. Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism Version 5.02 für Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com) durchgeführt.
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Ergebnisse
Auswirkungen von Mephedron auf die Methamphetamin-induzierte Neurotoxizität
Mephedron in Dosen (10, 20 oder 40 mg/kg), von denen bekannt ist, dass sie keine Toxizität der DA-Nervenenden verursachen (Angoa-Perez et al. 2012), wurde 30 Minuten vor jeder Methamphetamin-Injektion verabreicht. Methamphetamin wurde in Dosen verabreicht, die mäßige (4X 2,5 mg/kg) oder schwere (4X 5 mg/kg) Schäden an den DA-Nervenenden des Striatums verursachen (Thomas et al. 2004, Thomas et al. 2010). Die in Abb. 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Haupteffekte der Methamphetamin-Dosis (F1,40 = 66,60, p < 0,0001) und der Mephedron-Dosis (F4,40 = 131,3, p < 0,0001) auf den DA-Spiegel im Striatum bei der Zwei-Wege-ANOVA hoch signifikant waren. Der Haupteffekt von Mephedron in Kombination mit entweder 2,5 mg/kg (F4,22 = 35,96, p < 0,001) oder 5,0 mg/kg Methamphetamin (F4,17 = 953,9, p < 0,0001) war bei der einseitigen ANOVA ebenfalls hoch signifikant. Alle Behandlungen mit einer der beiden Methamphetamindosen ± Mephedron führten zu einer signifikant stärkeren Verringerung der DA im Vergleich zur jeweiligen Kontrolle (p < 0,0001 für alle). Abb. 1 zeigt auch, dass Mephedron-Dosen von 20 (p < 0,01) und 40 mg/kg (p < 0,001) die abbauenden Wirkungen von 2,5 mg/kg Methamphetamin auf den DA signifikant verstärkten, während alle Mephedron-Dosen die Wirkungen von 5,0 mg/kg Methamphetamin auf den DA-Spiegel signifikant verstärkten (p < 0,0001 für alle).
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Abb.1
Auswirkungen von Mephedron auf die Methamphetamin-induzierte Verringerung des striatalen DA-Spiegels. Mäuse wurden 30 Minuten vor jeder Injektion von 2,5 (-) oder 5,0 mg/kg (■) Methamphetamin (METH) mit den angegebenen Mephedron-Dosen (MEPH) behandelt und 2 Stunden später zur Bestimmung der striatalen DA-Konzentration mittels HPLC getötet. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM für 5-7 Mäuse pro Gruppe. Einige Fehlerbalken waren zu klein, um die Größe der Symbole zu überschreiten und sind nicht sichtbar. ***p < 0,001 gegenüber den Kontrollen und #p < 0,01, ##p < 0,001 oder ###p < 0,0001 gegenüber der jeweiligen Methamphetamin-Dosis (Tukey's multipler Vergleichstest).
Abb. 2a zeigt, dass Mephedron die durch Methamphetamin induzierte Verringerung der DAT-Konzentrationen signifikant verstärkte, wie durch Immunoblotting ermittelt wurde. Die Immunoblots wurden quantifiziert, und in Übereinstimmung mit den Ergebnissen für DA waren die Haupteffekte der Methamphetamin-Dosis (F1,92 = 9,48, p < 0,001) und der Mephedron-Dosis (F4,92 = 37,56, p < 0,0001) auf die DAT-Konzentrationen im Striatum durch die Zwei-Wege-ANOVA hoch signifikant (Abb. 2b). Der Haupteffekt von Mephedron in Kombination mit entweder 2,5 mg/kg (F4,56 = 15,55, p < 0,0001) oder 5,0 mg/kg Methamphetamin (F4,39 = 24,84, p < 0,0001) war bei der einseitigen ANOVA ebenfalls hoch signifikant. Alle Behandlungen mit einer der beiden Dosen Methamphetamin ± Mephedron führten zu signifikant stärkeren Reduzierungen der DAT im Vergleich zur jeweiligen Kontrolle (p < 0,01 für 2,5 mg/kg Methamphetamin allein; p < 0,0001 für alle anderen Behandlungen). Abb. 2b zeigt auch, dass Mephedron-Dosen von 20 mg/kg (p < 0,01) und 40 mg/kg (p < 0,001) die durch 2,5 mg/kg Methamphetamin verursachten Reduzierungen der DAT signifikant verstärkten, während nur die 40 mg/kg Mephedron-Dosis die Auswirkungen von 5,0 mg/kg Methamphetamin auf die DAT-Reduktionen signifikant verstärkte (p < 0,01).
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Abb.2
Auswirkungen von Mephedron auf Methamphetamin-induzierte Reduzierungen der striatalen DAT. Mäuse wurden 30 Minuten vor jeder Injektion von 2,5 (●) oder 5,0 mg/kg (■) Methamphetamin (METH) mit den angegebenen Mephedron-Dosen (MEPH) behandelt und 2d später für die Bestimmung der striatalen DAT-Konzentrationen durch Immunoblotting (a) getötet. Die Blots wurden mit ImageJ quantifiziert und die Daten sind Mittelwerte ± SEM für 10-12 Mäuse pro Gruppe (b). *p < 0,01 oder ***p < 0,0001 gegenüber der Kontrolle (C) und #p < 0,01 oder ##p < 0,001 gegenüber der jeweiligen Methamphetamin-Dosis (Tukey's multipler Vergleichstest).
Abb. 3a zeigt, dass Mephedron die durch Methamphetamin induzierte Verringerung des TH-Spiegels signifikant verstärkt, wie durch Immunoblotting ermittelt wurde. Die Immunoblots wurden quantifiziert, und in Übereinstimmung mit den obigen Ergebnissen für DA und DAT waren die Haupteffekte der Methamphetamin-Dosis (F1,81 = 47,89, p < 0,0001) und der Mephedron-Dosis (F4,81 = 63,57, p < 0,0001) durch eine Zweiwege-ANOVA hoch signifikant (Abb. 3b). Der Haupteffekt von Mephedron in Kombination mit entweder 2,5 mg/kg (F4,34 = 12,98, p < 0,0001) oder 5,0 mg/kg Methamphetamin (F4,49 = 99,16, p < 0,0001) war bei der einseitigen ANOVA ebenfalls hoch signifikant. Alle Behandlungen mit einer der beiden Dosen Methamphetamin ± Mephedron führten zu einer signifikant stärkeren Verringerung der TH-Werte im Vergleich zur jeweiligen Kontrolle (p < 0,001 für 2,5 mg/kg Methamphetamin + 10 mg/kg Mephedron; p < 0,0001 für alle anderen Kombinationen), mit Ausnahme von 2,5 mg/kg Methamphetamin allein, das die TH-Werte nicht signifikant veränderte (d. h. keine Toxizität). Abb. 3b zeigt auch, dass Mephedron-Dosen von 20 mg/kg (p < 0,01) und 40 mg/kg (p < 0,001) die durch 2,5 mg/kg Methamphetamin verursachten TH-Reduktionen signifikant verstärkten, und alle drei Mephedron-Dosen verstärkten signifikant (p < 0,0001) die Auswirkungen von 5,0 mg/kg Methamphetamin auf die TH-Reduktionen.
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Abb. 3.
Auswirkungen von Mephedron auf die Methamphetamin-induzierte Verringerung des striatalen TH. Mäuse wurden 30 Minuten vor jeder Injektion von 2,5 (●) oder 5,0 mg/kg (■) Methamphetamin (METH) mit den angegebenen Mephedron-Dosen (MEPH) behandelt und 2d später für die Bestimmung der striatalen TH-Konzentrationen durch Immunoblotting (a) getötet. Die Blots wurden mit ImageJ quantifiziert und die Daten sind Mittelwerte ± SEM für 10-12 Mäuse pro Gruppe (b). Einige Fehlerbalken waren zu klein, um die Größe der Symbole zu überschreiten, und sind daher nicht sichtbar. **p < 0,001 oder ***p < 0,0001 gegenüber der Kontrolle (C) und #p < 0,01, ##p < 0,001 oder ###p < 0,0001) gegenüber der jeweiligen Methamphetamin-Dosis (Tukey's multipler Vergleichstest).
Auswirkungen von Mephedron auf die Methamphetamin-induzierte Hyperthermie
Mephedron verursacht ebenso wie Methamphetamin eine erhebliche Hyperthermie (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Wenn Mephedron 30 Minuten vor jeder Methamphetamin-Injektion verabreicht wurde, ist in Abb. 4 zu erkennen, dass die Haupteffekte der Methamphetamin- und Mephedron-Dosen (F1,300 = 11,99, p < 0,0001) über die Zeit (F4,300 = 51,73, p < 0,0001) durch die Zwei-Wege-ANOVA hoch signifikant waren. Die Haupteffekte von Mephedron, das in Kombination mit entweder 2,5 mg/kg Methamphetamin (F4,120 = 41,44, p < 0,0001, Feld a) über die Zeit (F30,120 = 3,84, p < 0,0001) oder 5,0 mg/kg Methamphetamin (F4,120 = 78,09, p < 0,0001, Feld b) über die Zeit (F30,120 = 9,98, p < 0,0001) verabreicht wurde, waren bei der zweifachen ANOVA ebenfalls hoch signifikant. Alle Behandlungen mit einer der beiden Dosen von Methamphetamin ± Mephedron unterschieden sich signifikant von den jeweiligen Kontrollen (p < 0,0001 für alle Behandlungen).
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Abb. 4
Auswirkungen von Mephedron auf die Methamphetamin-induzierte Hyperthermie. Mäuse wurden 30 Minuten vor jeder Injektion von 2,5 (a) oder 5,0 mg/kg (b) Methamphetamin (METH) mit den angegebenen Mephedron-Dosen (MEPH) behandelt. Die Kerntemperaturen wurden ab 60 Minuten vor der ersten Methamphetamin-Injektion in 20-minütigen Abständen mittels Telemetrie gemessen. Die 4 Methamphetamin-Injektionen sind durch die auf der x-Achse ruhenden Pfeile gekennzeichnet. Die Daten sind als mittlere Körpertemperatur von 6-8 Mäusen pro Gruppe angegeben. Die SEMs betrugen immer < 10 % des Mittelwerts und werden aus Gründen der Übersichtlichkeit weggelassen.
Auswirkungen von Mephedron auf die Amphetamin- und MDMA-induzierte Neurotoxizität
Um zu prüfen, ob die verstärkenden Wirkungen von Mephedron auf Methamphetamin auf andere neurotoxische Amphetamine ausgedehnt werden können, wurden Mäuse mit diesem β-Ketoamphetamin (20 mg/kg) plus Amphetamin (4X 5 mg/kg) oder MDMA (4X 20 mg/kg) behandelt, und die Ergebnisse sind in Abb. 5 dargestellt. Es sei daran erinnert, dass Mephedron selbst keine Reduktion von striatalem DA, DAT oder TH bewirkt (Angoa-Perez et al. 2012). Der Haupteffekt der Droge (F5,27 = 27,18, p < 0,0001) war bei der einseitigen ANOVA für die DA-Reduktionen hoch signifikant (Abb. 5a). Aus Abb. 5a ist auch ersichtlich, dass alle Behandlungen mit Amphetamin (p < 0,001) oder MDMA (p < 0,001) allein oder in Kombination mit Mephedron (p < 0,0001 für beide Drogen) die DA-Werte gegenüber der Kontrolle signifikant senkten. Mephedron verstärkte signifikant die durch Amphetamin (p < 0,01) oder MDMA (p < 0,01) verursachten DA-Reduktionen. Abb. 5b zeigt ähnliche Auswirkungen der kombinierten Drogenbehandlung auf die DAT-Spiegel im Striatum. Der Haupteffekt der Droge (F4,49 = 42,63, p < 0,0001) war bei einer einseitigen ANOVA für DAT hoch signifikant. In Abb. 5b ist auch zu erkennen, dass alle Behandlungen mit Amphetamin oder MDMA im Vergleich zur Kontrolle signifikant (p < 0,0001 für alle) niedriger waren. Mephedron verstärkte auch signifikant die durch Amphetamin oder MDMA verursachten DAT-Reduktionen (p < 0,0001 in beiden Fällen). Schließlich zeigt Abb. 5c, dass der Haupteffekt der Droge (F4,50 = 75,06, p < 0,0001) bei der einseitigen ANOVA für die Verringerung der TH hoch signifikant war. In Abb. 5c ist auch zu erkennen, dass alle Behandlungen mit Amphetamin oder MDMA im Vergleich zur Kontrolle signifikant (p < 0,0001 für alle) niedriger waren. Mephedron verstärkte auch signifikant die durch Amphetamin oder MDMA verursachten TH-Reduktionen (p < 0,0001 in beiden Fällen)
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Abb. 5.
Auswirkungen von Mephedron auf die Amphetamin- oder MDMA-induzierte Neurotoxizität der DA-Nervenenden. Mäuse wurden 30 Minuten vor jeder Injektion von 5,0 mg/kg Amphetamin (AMPH) oder 20 mg/kg MDMA mit 20 mg/kg Mephedron (MEPH) behandelt und 2d nach der Behandlung zur Bestimmung der striatalen (a) DA-Konzentrationen mittels HPLC geopfert. (b) DAT und (c) TH wurden durch Immunoblotting bestimmt, und die Blots wurden mit ImageJ quantifiziert. Repräsentative Immunoblots für DAT und TH sind als Einschübe in den Tafeln (b) bzw. (c) zu sehen, und die Behandlungen sind in beiden Tafeln mit 1,5: Kontrolle; 2,6: MEPH; 3: AMPH; 4: AMPH + MEPH; 7: MDMA; und 8: MDMA + MEPH angegeben. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM für 5-12 Mäuse in jeder Gruppe. **p < 0,001 oder ***p < 0,0001 gegenüber der Kontrolle und #p < 0,01 oder ###p < 0,0001 gegenüber AMPH oder MDMA (Tukey's multipler Vergleichstest).
Auswirkungen von Nomifensin auf die Methamphetamin-induzierte Neurotoxizität
Nomifensin, ein starker DAT-Blocker ohne bekanntes Missbrauchs- oder neurotoxisches Potenzial, wurde auf seine Fähigkeit getestet, vor Methamphetamin-induzierter Neurotoxizität zu schützen, und auf den Kontrast zu den Wirkungen von Mephedron auf die durch Methamphetamin, Amphetamin und MDMA verursachte Toxizität an DA-Nervenenden. Die Ergebnisse in Abb. 6a zeigen, dass der Haupteffekt der Droge (F3,16 = 63,39, p < 0,0001) auf den DA-Spiegel bei einer einseitigen ANOVA hoch signifikant war. Nomifensin allein veränderte den DA-Spiegel nicht, aber die durch Methamphetamin verursachte Verringerung (p < 0,0001) wurde durch Nomifensin leicht, aber signifikant aufgehoben (p < 0,01). Der Haupteffekt der Droge (F3,20 = 16,78, p < 0,0001) auf die DAT-Konzentrationen war bei einer einseitigen ANOVA hoch signifikant, wie in Abb. 6b gezeigt. Nomifensin veränderte die DAT-Spiegel nicht, bot jedoch im Vergleich zur Kontrolle einen signifikanten Schutz (p < 0,001) vor der durch Methamphetamin verursachten Verringerung der striatalen DAT (p < 0,0001). Schließlich zeigt Abb. 6c, dass der Haupteffekt der Droge (F3,15 = 14,10, p < 0,0001) auf die TH-Konzentrationen bei einer einseitigen ANOVA hoch signifikant war. Wie bei DA und DAT wurde die durch Methamphetamin verursachte Verringerung der TH-Werte (p < 0,0001) durch Nomifensin (p < 0,01) leicht, aber signifikant verhindert.
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Abb. 6.
Auswirkungen von Nomifensin auf die Methamphetamin-induzierte Neurotoxizität der DA-Nervenenden. Mäuse wurden 30 Minuten vor jeder Injektion von 5,0 mg/kg Methamphetamin (METH) mit 5,0 mg/kg Nomifensin (NOM) behandelt und 2 Stunden später zur Bestimmung der striatalen (a) DA-Konzentration mittels HPLC getötet. (b) DAT und (c) TH wurden durch Immunoblotting bestimmt und die Blots wurden mit ImageJ quantifiziert. Repräsentative Immunoblots für DAT und TH sind in den Feldern (b) bzw. (c) als Beilage dargestellt. Die Daten sind Mittelwerte plus SEM für 5-7 Mäuse pro Gruppe. ***p < 0,0001 gegenüber der Kontrolle (C) und #p < 0,01 oder ##p < 0,001 gegenüber Methamphetamin allein (Tukey's multipler Vergleichstest).
Diskussion
Ziel der vorliegenden Studie war es, festzustellen, ob Mephedron die durch Methamphetamin verursachte Toxizität der DA-Nervenenden verhindern kann. Aufgrund seiner chemischen Ähnlichkeit mit Methamphetamin und MDMA wurde zunächst erwartet, dass Mephedron schädliche Auswirkungen auf das neuronale DA-System haben würde. In mehreren Studien wurde jedoch fast gleichzeitig festgestellt, dass Mephedron für DA-Nervenendigungen nicht toxisch ist (Angoa-Perez et al. 2012, Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011). Die Frage, ob diese Droge Schäden am neuronalen 5-HT-System verursacht, bleibt offen. In einer Studie wurde über eine anhaltende Verringerung der Funktion von 5-HT-Nervenenden berichtet (Hadlock et al. 2011), während in einer anderen Studie festgestellt wurde, dass Mephedron keine Schäden verursacht (Baumann et al. 2012). Mephedron interagiert mit der DA-Nervenendigung in einer Weise, die darauf schließen lässt, dass es tatsächlich die Freisetzung stimuliert und die DA-Wiederaufnahme über seine Interaktionen mit dem DAT blockiert. Ein wichtiger Aspekt des neurotoxischen Wirkmechanismus von Methamphetamin ist seine Fähigkeit, über die DAT Zugang zu den DA-Nervenenden zu erhalten und die DA-Homöostase zu stören (Sulzer 2011). Wenn dieser frühe Schritt in der neurotoxischen Kaskade von Methamphetamin durch Hemmung der DAT verhindert wird, wird die Toxizität verhindert (Pu et al. 1994, Poth et al. 2012, Marek et al. 1990, Schmidt und Gibb 1985). Wir gingen davon aus, dass Mephedron dieselbe schützende Wirkung haben könnte wie andere DAT-Hemmer, beobachteten aber stattdessen eine deutliche Verstärkung der Toxizität. Diese Wechselwirkung wurde mit zwei verschiedenen Methamphetamin-Dosen beobachtet, die mäßige bzw. schwere Schäden an den DA-Nervenenden verursachen (4X 2,5 bzw. 5,0 mg/kg). Diese potenzierende Wirkung von Mephedron war nicht auf Methamphetamin beschränkt, sondern erstreckte sich auch auf Amphetamin und MDMA, zwei Drogen, die häufig gemeinsam mit Mephedron und anderen β-Ketoamphetaminen konsumiert werden (Feyissa und Kelly 2008, Schifano et al. 2011, Kelly 2011). Obwohl Mephedron also zumindest für die DA-Nervenendigungen des Striatums keine Toxizität verursacht, verstärkt es die neurotoxischen Wirkungen anderer Drogen des Missbrauchs. Diese neue Erkenntnis sollte den Mephedron-Missbrauch in ein noch schärferes Licht rücken, da das Fehlen einer intrinsischen Neurotoxizität es als harmlos erscheinen lassen könnte.
Hyperthermie ist eine häufig berichtete akute unerwünschte Wirkung der Einnahme von Methamphetamin (Greene et al. 2008) und β-Ketoamphetamin beim Menschen (Borek und Holstege 2012, Prosser und Nelson 2012). Wie Methamphetamin führen auch viele der β-Ketoamphetamin-Drogen zu einer signifikanten Erhöhung der Kerntemperatur bei Nagern (Angoa-Perez et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Rockhold et al. 1997). Die durch Methamphetamin verursachte Hyperthermie könnte zwar zu den morphologischen und neuronalen Schäden beitragen, muss aber nicht unbedingt die direkte Ursache dieser Wirkungen sein (Kiyatkin und Sharma 2009). Wir haben die Körperkerntemperaturen von Mäusen gemessen, die mit Mephedron und Methamphetamin behandelt wurden, und festgestellt, dass die kombinierte Behandlung die Temperaturen nicht über den maximalen Anstieg hinaus erhöhte, der nach der alleinigen Behandlung mit einer der beiden Drogen beobachtet wurde. Methamphetamin verursachte einen dosisabhängigen Anstieg der Körpertemperatur, und diese Hyperthermie blieb über den gesamten getesteten Mephedron-Dosisbereich unverändert. Der nach der Mephedron-Behandlung beobachtete Rückgang der Körpertemperatur nach der Injektion (Angoa-Perez et al. 2012) blieb auch bei höheren Mephedron- und Methamphetamin-Dosen bestehen. Auch wenn die drogeninduzierte Hyperthermie durch die kombinierte Drogenbehandlung nicht verstärkt wurde, waren die neurotoxischen Wirkungen additiv. Daher scheint es zumindest im vorliegenden Fall, dass die neurotoxischen Wirkungen von Methamphetamin durch Mephedron auf eine Weise verstärkt werden können, die unabhängig von der Hyperthermie ist.
Mephedron hemmt eindeutig die DAT-Funktion und blockiert die DA-Wiederaufnahme in vitro (Lopez-Arnau et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Kehr et al. 2011, Martinez-Clemente et al. 2012, Cozzi et al. 1999). Mephedron verdrängt WIN-35,428 von seiner Bindungsstelle am DAT, was darauf hindeutet, dass es ein kompetitiver Inhibitor der DA-Aufnahme ist (Martinez-Clemente et al. 2012, Lopez-Arnau et al. 2012). Die Potenz von Mephedron ist in dieser Hinsicht sehr ähnlich wie die von Methamphetamin (Cozzi et al. 1999) und MDMA (Escubedo et al. 2011). Es ist nicht bekannt, ob Mephedron über den DAT transportiert wird, Methcathinon hingegen schon (Cozzi und Foley 2003). Nomifensin und Amphonelinsäure, die an die DAT binden und die DA-Aufnahme hemmen, bieten einen erheblichen Schutz vor Methamphetamin-induzierter Neurotoxizität (Pu et al. 1994, Marek et al. 1990, Schmidt und Gibb 1985, Poth et al. 2012), und Mäuse, denen die DAT fehlt, sind resistent gegen die neuronale Toxizität von Methamphetamin (Fumagalli et al. 1998). Das Wissen, dass Mephedron nicht neurotoxisch und ein DAT-Blocker ist, führt zu der Vorhersage, dass es die Toxizität verhindern sollte. Wir testeten Nomifensin in dieser Hinsicht als Positivkontrolle und bestätigten, dass es vor der Methamphetamin-induzierten Depletion von DA, DAT und TH schützt. Nomifensin hemmt auch den Noradrenalin-Transporter (Brogden et al. 1979), aber diese Eigenschaft kann die vorliegenden Ergebnisse nicht erklären, da die meisten β-Ketoamphetamine, einschließlich Mephedron, den Noradrenalin-Transporter hemmen und die Noradrenalin-Aufnahme blockieren (Kelly 2011, Rothman et al. 2003, Cozzi et al. 1999, Sogawa et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012). Eine Rolle des neuronalen 5-HT-Systems bei einigen der pharmakologischen Wirkungen von Mephedron ist möglich, da diese Droge wie MDMA (Yamamoto et al. 1995) in der Lage ist, über ihre Wechselwirkungen mit 5-HT2A-Rezeptoren einen Efflux von striatalem DA zu verursachen (Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012). Die durch Mephedron hervorgerufene Hyperbewegung ist von endogenem 5-HT abhängig (Lopez-Arnau et al. 2012), und diese Droge stimuliert auch die Freisetzung von 5-HT und hemmt dessen Aufnahme in vitro (Sogawa et al. 2011, Cozzi et al. 1999, Nagai et al. 2007, Hadlock et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012) und in vivo (Baumann et al. 2012, Kehr et al. 2011). Wir können jedoch ausschließen, dass endogenes 5-HT bei der DA-Neurotoxizität zumindest von Methamphetamin eine Rolle spielt, da wir zeigen konnten, dass Mäuse, denen genetisch 5-HT entzogen wurde, ihre Empfindlichkeit gegenüber Neurotoxizität beibehalten (Thomas et al. 2010).
Mephedron könnte die Neurotoxizität von Methamphetamin durch mehrere mögliche Mechanismen verstärken. Erstens könnte Mephedron mit der VMAT interagieren und ein Austreten von DA in das Zytoplasma der präsynaptischen Nervenendigung bewirken. Behandlungen, die den zytoplasmatischen DA-Pool (d. h. den durch die Droge freisetzbaren) erhöhen, steigern die Neurotoxizität von Methamphetamin (Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009, Schmidt et al. 1985). Dieser Mechanismus ist nicht wahrscheinlich, da Methcathinon nur schwach mit dem VMAT interagiert (Cozzi et al. 1999). Zweitens könnte die Kombination von Mephedron und Methamphetamin eine synergistische Wirkung auf die nichtvesikuläre Freisetzung von DA haben, aber auch diese Möglichkeit erscheint unwahrscheinlich angesichts der Ergebnisse, die zeigen, dass die Behandlung von DAT- oder SERT-exprimierenden CHO-Zellen mit Methylon plus Methamphetamin keine additive Wirkung auf die DA- oder 5-HT-Freisetzung hat (Sogawa et al. 2011). Drittens könnte Mephedron auf eine neuartige Weise mit der DAT interagieren, die zur additiven Toxizität beiträgt. Es wurde nachgewiesen, dass Methylon in Kombination mit Methamphetamin in CHO-Zellen, die den DAT oder SERT exprimieren, eine synergistische Zytotoxizität verursacht, nicht aber in CHO-Wildtyp-Zellen, denen diese Transporter fehlen (Sogawa et al. 2011). Die in diesen Studien in kultivierten Zellen beobachtete Zytotoxizität (d. h. die LDH-Freisetzung) unterscheidet sich stark von der durch Methamphetamin verursachten Schädigung der DA-Nervenendigungen, aber dieser Mechanismus deutet auf eine interessante, aber nicht definierte Rolle des DAT bei der erhöhten Zytotoxizität hin. Schließlich könnte Mephedron den Methamphetamin-Metabolismus verändern. Mephedron wird hauptsächlich durch N-Demethylierung metabolisiert (Meyer und Maurer 2010), ebenso wie Methamphetamin und MDMA (Caldwell 1976). Unterstützt wird dieser Mechanismus durch den Nachweis, dass Methamphetamin und MDMA gegenseitig die Produktion ihrer jeweiligen primären Metaboliten hemmen und die Plasmaspiegel der Droge über die nach der Verabreichung einer der beiden Drogen allein gemessenen Werte hinaus erhöhen (Kuwayama et al. 2012). Die hier und in unserer früheren Studie (Angoa-Perez et al. 2012) verwendeten Mephedron-Dosen sind zwar hoch, aber nicht neurotoxisch und liegen im Bereich des menschlichen Missbrauchs (McErath und O'Neill 2011). Daher könnte Mephedron ähnlich wie MDMA die Plasmaspiegel von Methamphetamin erhöhen, indem es dessen Metabolismus hemmt. Eine eingehende pharmakokinetische Analyse wird erforderlich sein, um diese letzte Möglichkeit zu bestätigen.
Der Missbrauch von β-Ketoamphetaminen nimmt in besorgniserregendem Maße zu, und Mephedron ist inzwischen eine der am häufigsten konsumierten Drogen nach Cannabis, MDMA und Kokain (Morris 2010, Winstock et al. 2011b). Darüber hinaus löst Mephedron bei Menschen im Vergleich zu MDMA ein stärkeres Verlangen aus (Brunt et al. 2011), und Konsumenten, die Mephedron schnupfen, schätzen es als süchtig machender ein als Kokain (Winstock et al. 2011b). Mephedron wird von Menschen in Form von Saufgelagen (d. h. "Stacking") konsumiert und häufig zusammen mit anderen Drogen wie Cannabis und Amphetamin-Psychostimulanzien eingenommen (Schifano et al. 2011, Fass et al. 2012, Winstock et al. 2011a, Kelly 2011, Torrance und Cooper 2010). Mephedron wird zunehmend in Tabletten gefunden, die als MDMA verkauft werden (Brunt et al. 2011), und sein Konsum wird wahrscheinlich den von MDMA übertreffen, da der Reinheitsgrad der letzteren Droge weiter sinkt (Brunt et al. 2011, Tanner-Smith 2006, Teng et al. 2006). Angesichts der verbreiteten Missbrauchsmuster von Mephedron und anderen "Badesalz"-Bestandteilen ist es wichtig zu prüfen, ob beim Menschen zusätzliche Gesundheitsrisiken entstehen, wenn diese Drogen absichtlich oder unabsichtlich mit Amphetaminen kombiniert werden. Unsere Ergebnisse, die zeigen, dass zumindest Mephedron die durch Methamphetamin, Amphetamin und MDMA verursachte Neurotoxizität an den DA-Nervenenden des Striatums deutlich verstärkt, offenbaren eine besonders gefährliche und unerwartete Eigenschaft dieses β-Ketoamphetamins.
Verwendete Abkürzungen
5-HT Serotonin
DA Dopamin
DAT DA-Transporter
MDMA 3,4-Methylendioxymethamphetamin
TH Tyrosin-Hydroxylase
VMAT vesikulärer Monoamintransporter
